2021年5月6日，中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究院韓敬東研究組在Nature Aging期刊在線發(fā)表了研究成果“Aging-associated lncRNAs are evolutionarily conserved and participate in NFκB signaling”。該研究通過生物信息學(xué)方法分析了11個(gè)物種衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與衰老相關(guān)的lncRNAs具有更強(qiáng)的進(jìn)化保守性，富集在功能相關(guān)的數(shù)據(jù)庫中，轉(zhuǎn)錄因子富集分析和功能預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)與衰老相關(guān)的lncRNAs參與NFκB信號(hào)通路的調(diào)控，通過CRISPR功能篩選發(fā)現(xiàn)了13個(gè)與進(jìn)化保守和衰老相關(guān)的lncRNAs可以調(diào)控NFκB信號(hào)通路，為提高健康衰老生活質(zhì)量提供了重要的理論基礎(chǔ)和新思路。
衰老是機(jī)體不可避免的過程，表現(xiàn)為組織和器官的逐步衰竭與疾病和死亡風(fēng)險(xiǎn)的增加。在人類近200年的社會(huì)發(fā)展中，由于生活水平的提高和醫(yī)療資源水平的提升，雖然人類的期望壽命延長了近一倍，但健康壽命（healthspan）卻僅僅增加了4.6年。更長的壽命意味著患慢性病風(fēng)險(xiǎn)的增加，如心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等，而衰老進(jìn)程也影響了感知、運(yùn)動(dòng)和認(rèn)知功能，從而降低了晚年生活質(zhì)量（Partridge et al, Nature 2018）。轉(zhuǎn)錄組的改變作為衰老過程中重要的分子特征，可以作為各個(gè)器官功能衰退的分子標(biāo)志物（Benayoun et al, Genome Research 2019）。通過高通量測序技術(shù)，研究人員揭示了在不同組織中衰老相關(guān)的基因表達(dá)譜（Cheng et al, PNAS 2018; Schaum et al, Nature 2020; Tabula et al, Nature 2020; Ahadi et al, Nat Med 2020），揭示在大腦、肝臟等組織的衰老過程中，轉(zhuǎn)錄組中蛋白編碼基因表達(dá)的變化主要與炎癥反應(yīng)相關(guān)，同時(shí)強(qiáng)調(diào)將慢性炎癥指標(biāo)作為衰老的標(biāo)志物（Ori et al, Cell Syst 2015）。
目前關(guān)于轉(zhuǎn)錄組測序中與衰老相關(guān)的非編碼RNA功能鮮有報(bào)道，而在Gencode數(shù)據(jù)庫中非編碼RNA的數(shù)量比蛋白編碼基因更多，因此探索非編碼RNA在衰老過程中的表達(dá)發(fā)生變化的原因，了解其參與調(diào)控衰老過程的研究顯得尤為重要。
韓敬東研究組長期致力于衰老相關(guān)的機(jī)制研究。研究人員通過生物大數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)衰老過程中l(wèi)ncRNAs的特性，并通過CRISPR功能篩選出能調(diào)控NFκB信號(hào)通路的衰老相關(guān)lncRNAs?；谘芯拷M在衰老人群的腦和血液研究中獲得的相關(guān)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（Cheng et al, PNAS 2018; Xia et al, Nat Metab?2020）和NCBI數(shù)據(jù)庫中10個(gè)物種衰老相關(guān)的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，將11個(gè)物種的基因組進(jìn)行同源比對和轉(zhuǎn)錄本相似性兩兩組合分析，得到這11個(gè)物種間的蛋白編碼基因和非編碼RNA的進(jìn)化保守性狀態(tài)（圖1）。按照進(jìn)化年齡構(gòu)建出11個(gè)物種的進(jìn)化樹，并把物種特異或保守?cái)?shù)目標(biāo)注在進(jìn)化樹中，得知大部分lncRNA都有物種特異性，并識(shí)別出9032 (26%)個(gè)人的lncRNA保守到其它物種中，在衰老相關(guān)的蛋白編碼基因中顯著保守，并隨進(jìn)化年齡富集程度增加；在血液衰老相關(guān)的lncRNA中，其保守程度也隨著進(jìn)化年齡而增加；與腦部衰老相關(guān)的lncRNA的保守程度在脊椎動(dòng)物中有所增加。同樣，功能相關(guān)的lncRNA會(huì)隨著進(jìn)化年齡而出現(xiàn)富集程度的增加。為了研究與衰老相關(guān)的lncRNA是否受到更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，研究人員掃描了轉(zhuǎn)錄因子在基因的啟動(dòng)子區(qū)域，并計(jì)算其富集分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)與衰老相關(guān)的蛋白編碼基因和lncRNA的轉(zhuǎn)錄因子的富集程度比非衰老相關(guān)的基因更強(qiáng)，有40個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的motif富集在9個(gè)脊椎動(dòng)物與衰老相關(guān)的lncRNAs中，其中包含RELA，RUNX1和BCL6。
圖1. 11個(gè)物種間兩兩比對識(shí)別同源基因流程圖
為了研究與衰老相關(guān)的lncRNA的潛在功能，研究人員采用guilt-by-association方法基于與蛋白基因表達(dá)的相關(guān)性來預(yù)測lncRNA的功能。發(fā)現(xiàn)腦衰老上調(diào)的lncRNA與免疫功能相關(guān)，如NFκB信號(hào)通路和細(xì)胞因子受體；腦衰老下調(diào)的lncRNA與神經(jīng)系統(tǒng)功能相關(guān)，如神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和突觸延伸；而血液衰老相關(guān)的lncRNA與NFκB信號(hào)通路和線粒體功能密切相關(guān)。由于預(yù)測的功能與蛋白編碼基因的功能高度相似，研究人員推測衰老相關(guān)的lncRNA與蛋白編碼基因被相似的信號(hào)通路調(diào)控，并對腦衰老和血液衰老的lncRNA做轉(zhuǎn)錄因子的motif富集分析，發(fā)現(xiàn)上調(diào)的lncRNA均富集了RELA的motif。通過REMAP ChIP-seq數(shù)據(jù)庫對lncRNA富集分析同樣發(fā)現(xiàn)NFKB1和RELA的顯著富集。為了研究與衰老相關(guān)的lncRNA是否具有調(diào)節(jié)NFκB信號(hào)通路的功能，在NFκB的報(bào)告細(xì)胞中通過CRISPR篩選調(diào)控NFκB的lncRNA，獲得了顯著調(diào)低GFP（p<0.05）的64個(gè)蛋白編碼基因和72個(gè)lncRNA。通過對72個(gè)GFP低的lncRNA注釋進(jìn)化年齡、衰老相關(guān)性和啟動(dòng)子區(qū)域的RELA motif，篩選出符合上述三個(gè)條件的13個(gè)與NFκB調(diào)控衰老相關(guān)的lncRNA (NFKBMARLs)，并對它們標(biāo)上在TNFα的單核細(xì)胞和細(xì)胞衰老相關(guān)的反應(yīng)，以研究其調(diào)節(jié)衰老相關(guān)表形，重點(diǎn)研究其中NFKBMARL-1對NFκB調(diào)控通路的信號(hào)機(jī)制（圖2）。采用ChIP-qPCR，RIP-qPCR技術(shù)識(shí)別NFKBMARL-1調(diào)節(jié)RELA結(jié)合NFKBIZ的啟動(dòng)子區(qū)域，發(fā)現(xiàn)NFKBMARL-1參與了RELA的相分離過程。
圖2. NFKBMARL-1調(diào)控NFKBIZ的模式圖。
綜上，該研究發(fā)現(xiàn)了與衰老相關(guān)的lncRNA具有進(jìn)化保守性。功能富集分析發(fā)現(xiàn)了與衰老相關(guān)的lncRNA的重要生物學(xué)相關(guān)功能，如癌癥相關(guān)的生存曲線、疾病相關(guān)的GWAS位點(diǎn)分布等。同時(shí)，與衰老相關(guān)的lncRNA有更多的轉(zhuǎn)錄因子富集在啟動(dòng)子區(qū)域、更多的RNA結(jié)合蛋白富集在轉(zhuǎn)錄本上，并且在TAD區(qū)域中與衰老相關(guān)的RNA更加保守。更為重要的是，衰老過程上調(diào)的lncRNA富集了RELA轉(zhuǎn)錄因子，其功能在NFκB信號(hào)通路中富集顯著。通過對NFκB信號(hào)通路的CRISPR進(jìn)行功能篩選，同樣富集在衰老相關(guān)的lncRNA中，具有更強(qiáng)的進(jìn)化保守性。構(gòu)建出13個(gè)NFKBMARLs，其中NFKBMARL-1在炎癥和細(xì)胞衰老過程中同樣顯著上調(diào)。一系列RNA分子生物學(xué)及組學(xué)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，NFKBMARL-1直接結(jié)合NFκB順式及臨近的NFκB下游基因NFKBIZ促進(jìn)并放大NFκB信號(hào)，抑制NFKBMARL-1則能夠抑制NFκB的信號(hào)通路并遏制衰老相關(guān)的炎癥因子表達(dá)。
中國科學(xué)院上海營養(yǎng)與健康研究所、北京大學(xué)韓敬東研究組博士生蔡?hào)|宏為該論文的第一作者，韓敬東研究員為該論文的通訊作者。上述研究獲得了科技部、國家自然科學(xué)基金和上海市項(xiàng)目的資助。
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